Ein DNA-Assemblierungs-Toolkit zur Erschließung des CRISPR/Cas9-Potenzials für das Metabolic Engineering

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 858 (2023) Diesen Artikel zitieren

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CRISPR/Cas9-basierte Technologien revolutionieren die Art und Weise, wie wir mikrobielle Zellen entwickeln. Einer der Hauptvorteile von CRISPR beim Stammdesign besteht darin, dass es die chromosomale Integration markerfreier DNA ermöglicht und aufwändige und oft ineffiziente Markerwiederherstellungsverfahren überflüssig macht. Trotz der Vorteile ist die Zusammenstellung von CRISPR/Cas9-Bearbeitungssystemen immer noch kein einfacher Prozess, was deren Verwendung und Anwendungen verhindern kann. In dieser Arbeit haben wir einige der Haupteinschränkungen aktueller Cas9-Toolkits identifiziert und Verbesserungen entwickelt, mit dem Ziel, den Zugriff und die Implementierung von CRISPR-Technologien zu erleichtern. Dazu gehören 1) ein System zum schnellen Wechsel zwischen markerfreien und markerbasierten Integrationskonstrukten unter Verwendung von Cre-exprimierenden und Standard-Escherichia-coli-Stämmen, 2) die Fähigkeit, Multigen-Integrationskassetten über einen Golden-Gate-basierten Austausch in alternative genomische Loci umzuleiten von Homologiearmen, 3) eine schnelle, einfache In-vivo-Methode zum Zusammenbau von Guide-RNA-Sequenzen durch Rekombination zwischen Cas9-Helferplasmiden und einzelnen Oligonukleotiden. Wir kombinieren diese Methoden mit etablierten Technologien zu einem umfassenden Toolkit für effizientes Metabolic Engineering mit CRISPR/Cas9. Als Proof of Concept haben wir das YaliCraft-Toolkit für Yarrowia lipolytica entwickelt, das aus einem Basissatz von 147 Plasmiden und 7 Modulen mit unterschiedlichen Zwecken besteht. Wir haben das Toolkit verwendet, um eine Bibliothek von 137 Promotoren zu erstellen und zu charakterisieren und einen De-novo-Stamm aufzubauen, der 373,8 mg/L Homogentisinsäure synthetisiert.

Die Entwicklung von CRISPR/Cas9-basierten Technologien hat schnelle, präzise und narbenlose Genommodifikationen ermöglicht, was ein großes Potenzial für die Gestaltung und Bioproduktion mikrobieller Stämme zeigt. Insbesondere das Metabolic Engineering von Hefen ist einer der am schnellsten wachsenden Bereiche der Ingenieurbiologie und ermöglicht die nachhaltige Produktion von Chemikalien, Kraftstoffen, Materialien, Lebensmitteln und Pharmazeutika1. Obwohl sie über das große Stoffwechselpotenzial eukaryotischer Zellen verfügen, sind Hefen aufgrund ihrer Einzelzellnatur und ihres schnellen Wachstums einfacher zu konstruieren und im großen Maßstab zu kultivieren.

Aus diesem Grund wurden CRISPR-Systeme für Hefen entwickelt2,3,4. Einer der wichtigsten Vorteile von CRISPR besteht darin, dass es aufgrund seiner hohen Effizienz markerlose Genomveränderungen ermöglicht. Beim traditionellen Stamm-Engineering ist die Eliminierung selektierbarer Marker aus dem Genom, bekannt als Marker-Recovery, ein häufiger Engpass5. Selbst schnell wachsende Hefekulturen benötigen mindestens fünf Tage für die Markerwiederherstellung6, während die integrative Transformation selbst nur zwei oder drei Tage dauert. Daher wurden in den letzten Jahren mehrere durch CRISPR ermöglichte markerfreie Integrationstechniken entwickelt6,7,8,9. Trotz dieser Entwicklungen stützen sich viele aktuelle Metabolic-Engineering-Projekte immer noch auf markerbasierte Ansätze, was den Erfolg bei der Stammoptimierung einschränken oder verzögern kann. In dieser Arbeit haben wir drei Verbesserungen von CRISPR/Cas9-Systemen identifiziert, die den Einsatz von Cas9-basiertem Hefe-Engineering erleichtern könnten: (1) der einfache Wechsel zwischen Marker- und markerlosen Modifikationen (2) der schnelle Austausch von Homologiearmen, um unterschiedliche Integrationen anzustreben Standorte und (3) eine einfache Methode zum Klonen von gRNAs.

Bei der CRISPR-basierten markerfreien Integration ist der durch Cas9 induzierte Doppelstrangbruch (DSB) der einzige selektive Faktor. Um sich zu vermehren, müssen Zellen diese Läsion reparieren. Dies kann entweder durch die Verwendung einer Vorlage (Donor) geschehen, die über homologe Rekombination (HR) integriert wird, oder durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ), also ohne Integration. NHEJ-Aktivität wird bei den meisten Pilzarten beobachtet, einschließlich der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae5,10. Bei Arten, bei denen NHEJ der vorherrschende Mechanismus ist, besteht eine gängige Strategie zur Verbesserung der HR darin, NHEJ-Gene (KU70, KU80, POL4 und DNL4) zu löschen11. Diese Strategie verbessert zwar das Personalwesen, verhindert jedoch nicht vollständig die unerwünschte NHEJ-Aktivität12. Daher stellt die Isolierung von Transformanten mit Modifikationen, die zu Phänotypen mit langsamem Wachstum führen, ein allgemeines Problem bei markerfreien Integrationsansätzen dar. Dies liegt daran, dass von NHEJ produzierte Indel-Mutanten seltene und langsam wachsende integrative Transformanten überwachsen und maskieren können. Obwohl erfolglose technische Bemühungen selten veröffentlicht werden, gibt es ein Beispiel im Zusammenhang mit der Störung des SDH5-Gens in Yarrowia lipolytica. Trotz mehrerer Versuche konnte diese Modifikation nicht mit einer CRISPR-basierten markerfreien Strategie isoliert werden13, wohingegen die erfolgreiche Löschung mit einem auxotrophen Marker erreicht wurde14. Ähnliche Beobachtungen sind bei Hefetechnikarbeiten weit verbreitet, bei denen einige Loci oft leichter zu modifizieren sind als andere, während einige erfolglos bleiben – teilweise aufgrund der Schwierigkeit, langsam wachsende Hefen auszuwählen. Solche Mutationen mit schädlichen Auswirkungen auf das Zellwachstum kommen im Metabolic Engineering häufig vor15. Genomweite Studien von S. cerevisiae ergaben, dass die Überexpression von 20 % der Gene16 und die Störung von 15 % der nicht-essentiellen Gene17 das Zellwachstum negativ beeinflussen. Darüber hinaus kann die Lebensfähigkeit der Zellen durch epistatische Wechselwirkungen zwischen Modifikationen in nicht-allelischen Genen beeinträchtigt werden18. Daher können technische Ansätze, die auf markerfreier Integration basieren, gelegentliche (aber schwer vorhersehbare) Fälle beinhalten, in denen eine strenge Auswahl auf der Grundlage eines auxotrophen Markers erforderlich ist. In diesen Fällen müsste eine neue Kassette wieder zusammengebaut werden, was den Fortschritt erheblich verzögert. Eine gewünschte Verbesserung der CRISPR/Cas9-unterstützten Integrationssysteme wäre daher eine Methode, um einfach zur markerbasierten Integration zurückzukehren, wenn der markerfreie Versuch fehlschlägt.

Für die Cas9-unterstützte Integration ist eine Spendervorlage erforderlich, die aus einer Integrationskassette besteht, die von zwei Homologiearmen (HAs) flankiert wird. Jedes HA-Paar zielt auf einen einzigartigen Genom-Locus ab und kann in einem bestimmten Stamm nur einmal für die Überexpression einer begrenzten Anzahl von Transkriptionseinheiten (TUs) verwendet werden. Mit dem Fortschritt der synthetischen Biologie steigt die durchschnittliche Anzahl der Modifikationen pro Stamm. Daher muss die Zahl der für die homologe Integration geeigneten Genomstellen parallel wachsen. Dementsprechend wurden Sätze gebrauchsfertiger Donorvektoren mit unterschiedlichen HAs für die meisten industriell relevanten Hefen wie S. cerevisiae19, Ogataea polymorpha20, Kluyveromyces marxianus21, Komagataella phaffii22 und Y. lipolytica9 entwickelt. Die Anwendung der Eintopf-Golden-Gate-Baugruppe (GG) ermöglicht ein effizientes System zum Aufbau mehrerer TUs auf den für das Vektorlager erforderlichen HAs23. Allerdings verzögert die Änderung der HAs einer konstruierten Integrationskassette in der Regel den technischen Fortschritt, da oft die Erstellung einer neuen Kassette von Grund auf oder die Verwendung weniger praktischer Klonierungstechniken wie Restriktionsligation oder Gibson-Assemblierung erforderlich ist. Die Möglichkeit, ein vorgefertigtes Spenderkonstrukt einfach an einen alternativen Integrationsort umzuleiten, würde metabolische Engineering-Ansätze beschleunigen. Darüber hinaus würde es die Integration mehrerer Kopien einer TU im gesamten Genom ermöglichen und die Möglichkeit bieten, eine Konstruktion an einem bestimmten Ort durch eine andere zu ersetzen. Wir nehmen daher an, dass ein ideales CRISPR/Cas9-vermitteltes Integrationssystem die Fähigkeit besitzen sollte, HAs auf vormontierten Cas9-Donorkonstrukten unter Verwendung einer vereinfachten GG-Reaktion auszutauschen.

Im Gegensatz zu anderen Techniken erfordert die CRISPR/Cas9-vermittelte Integration den Entwurf, Zusammenbau und die Transformation eines zusätzlichen Konstrukts, das eine variable gRNA-Sequenz exprimiert. Ein gängiger und effizienter Ansatz kombiniert beide genetischen Elemente, die Cas9 und die gRNA, auf demselben episomalen Helfer, was ihre vorübergehende Expression nach der Co-Transformation mit einem Spender gewährleistet24. Um das Schneid- und Rekombinationsereignis an eine neue Position umzuleiten, müssen nur 20 Basen der gRNA-Sequenz geändert werden. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Assemblierungstechniken eingesetzt, darunter USER-Klonen9, GG-Assembly25 und klonfreie Ansätze26. Darüber hinaus wurde eine neue und effiziente alternative Methode zur Modifizierung einer gRNA auf dem Escherichia coli-Chromosom entwickelt27, die aus der Verwendung von Rekombination und einem einzelnen 90-Basen-Oligonukleotid besteht, das die spezifischen 20 Nukleotide in der Mitte der Sequenz enthält. Obwohl die Rekombination in Eukaryoten nicht effizient ist, kann das erforderliche Plasmid-Helfer möglicherweise durch einen schnellen Schritt in E. coli zusammengesetzt werden. Wir glauben, dass die Implementierung einer schnellen gRNA-Neukodierungsmethode mittels Rekombination den CRISPR/Cas9-unterstützten Integrationssystemen zugute kommen könnte.

Ein Schlüsselelement jedes Metabolic-Engineering-Projekts sind Promotoren, die die Regulierung von Stoffwechselnetzwerken ermöglichen, um den Fluss in Richtung gewünschter Produkte umzulenken28. Die meisten Toolkits für die synthetische Hefebiologie umfassen eine Reihe charakterisierter Promotoren. Bei vielen nicht-konventionellen Hefen ist NHEJ jedoch stark und die Verwendung markerbasierter Techniken zur Charakterisierung von Promotoren kann ungenau sein, da eine zufällige Integration zu mehreren Integrationsereignissen führen kann11,29,30. Gleichzeitig sollte die Charakterisierung neuer Promotoren idealerweise in einem standardisierten genetischen Kontext erfolgen, also als Einzelkopie-Integration in eine definierte Genomposition. Dies kann durch CRISPR-vermittelte DSBs erleichtert werden, von denen bekannt ist, dass sie die Integration um mehr als das Tausendfache verbessern2,31. Daher wäre die Einbindung von CRISPR-basierten Methoden zur Promotorcharakterisierung für viele Hefesysteme von Vorteil und würde die einfache und schnelle Analyse großer Promotorbibliotheken erleichtern. Darüber hinaus ermöglicht es einen besseren Vergleich der Promotorstärken zwischen Laboren.

Hier haben wir am Beispiel der Industriehefe Y. lipolytica ein modulares Metabolic-Engineering-Toolkit (YaliCraft) entwickelt, das etablierte Strategien zur Genbearbeitung und DNA-Assemblierung mit neu implementierten Methoden kombiniert, um die vier oben beschriebenen Konzepte anzugehen, was eine hohe Effizienz zeigte und Vielseitigkeit (Abb. 1).

Das Toolkit besteht aus sieben Modulen zur schnellen und einfachen Zusammenstellung integrativer Konstrukte und Cas9-Helferplasmide. Lvl0-Modul: Einzelteile in Eintragsvektoren. Exp-Modul: Zusammenstellung von Überexpressionskonstrukten. Pro-Modul: Zusammenstellung und Screening neuer Promoter. Del-Modul: Zusammenbau von Störungskonstrukten. Int-Modul: Veränderung der Integrationsorte durch Homologie-Arme-Austausch. MEx-Modul: Zusammenbau markerfreier Konstrukte durch wählbare Markerentfernung. Cas-Modul: Umleitung des Cas9-Helfers zu neuen Genom-Loci. Fünf der Module – Pro-, Del-, Cas-, Int- und MEx-Module – stellen eine neue Methodik dar, die bisher verwendete GG-Montagesysteme funktional erweitert. Der Zusammenbau der Pro-, Del- und Int-Module basiert auf einzelnen GG-Reaktionen, während bei den Cas- und MEx-Modulen homologe und ortsspezifische Rekombinationen in den speziellen E. coli-Stämmen stattfinden. Die Pfeile zwischen den Modulen zeigen unterschiedliche Reihenfolgen an, in denen sie angewendet werden können, um variable Genom-Engineering-Techniken zu ermöglichen, wie im oberen Bereich, Hefe, gezeigt. Ergänzende Tabelle 8 ist eine Liste der Hauptplasmide des Toolkits.

Y. lipolytica ist eine ölhaltige Hefe mit hoher Bioproduktionskapazität, die in der Industrie große Aufmerksamkeit erregt32. Y. lipolytica weist, wie die meisten nichtkonventionellen Hefen, eine begrenzte HR-Kapazität auf und daher hat sich der Einsatz der CRISPR/Cas9-vermittelten Integration als wirksam erwiesen33,34,35. Aufgrund der Relevanz dieser Hefe wurden mehrere modulare Toolkits für diesen Organismus entwickelt9, 36,37,38,39,40,41, obwohl keines davon direkt auf die oben beschriebenen Probleme eingeht.

Wir präsentieren hier das YaliCraft-Toolkit, vollständig beschrieben in einem detaillierten 44-seitigen Handbuch (Ergänzungsmaterial), das aus sieben Modulen besteht, die in unterschiedlichen Kombinationen angewendet werden können und die Überexpression oder Störung von Genen, die Umleitung von gRNA und Donor ermöglichen. die gleichzeitige Zusammenstellung von Spendern mit und ohne Marker sowie das Screening großer Bibliotheken von Promotoren, um sie sofort für Genüberexpressionen verfügbar zu machen. Um den Nutzen des entwickelten CRISPR/Cas9-Systems zu demonstrieren, haben wir das größte Bündel von Promotoren charakterisiert, das jemals in Y. lipolytica beschrieben wurde, und einen Stamm entwickelt, der de novo hohe Titer an Homogentisinsäure (HGA) aus Glucose produziert.

Um das volle Potenzial der CRISPR/Cas9-Technologie für das Metabolic Engineering auszuschöpfen, haben wir ein Toolkit mit einer Struktur entwickelt, die auf 7 Einzelmodulen basiert und die bereits bekannten GG-Montagesysteme23,36,37,42 erweitert. Wir haben die Syntax früherer Yarrowia-Toolkits beibehalten, um den Austausch kompatibler Teile36,37 zu erleichtern, und eine hierarchische Struktur basierend auf dem weit verbreiteten Hefe-Toolkit23 implementiert. Jedes Modul umfasst eine bestimmte Art molekularer Operation, die den endgültigen Vektor modifiziert. Solche Operationen sind entweder eine In-vitro-Eintopf-GG-Reaktion oder eine In-vivo-Rekombination in E. coli. Jeder Schritt erfordert zwei Tage, um Konstrukte für den nächsten Modifikationsschritt oder für die Hefetransformation vorzubereiten (Ergänzungstabelle 1). Einige Vorgänge, z. B. GG-Montage und Markerentfernung, können in einem einzigen Schritt kombiniert werden. Die Module wurden so konzipiert, dass sie in verschiedenen Reihenfolgen und Kombinationen verwendet werden können, was ein Höchstmaß an Freiheit ermöglicht und gleichzeitig die Anzahl der Schritte rationalisiert, die erforderlich sind, um ein gewünschtes Konstrukt zu erhalten (Abb. 1 oder ergänzende Abb. 1).

Das Lvl0 (Level 0) Modul besteht aus einer Sammlung einzelner genetischer Elemente, die leicht erweitert werden können. Im Exp (Expression)-Modul können diese Teile in einer Vielzahl integrativer Überexpressionsvektoren mit den gewünschten Kombinationen von Promotoren, Genen, Terminatoren, HAs und selektierbaren Markern kombiniert werden. Das Pro (Promoter)-Modul ermöglicht die Charakterisierung neuer Promotoren in Hefe und ist vollständig kompatibel mit dem Exp-Modul. Das Del (Deletion)-Modul ermöglicht den einstufigen Aufbau markerbasierter Konstruktionen für Genstörungen. Das Int (Integration)-Modul implementiert die schnelle Umleitung vorgefertigter Überexpressionskonstruktionen zu alternativen Genom-Loci über den HA-Austausch. Das MEx-Modul (Marker Excision) wurde entwickelt, um die Generierung einer markerfreien Version eines beliebigen Integrationskonstrukts mithilfe eines bestimmten Assembly-Hosts EcoCre zu ermöglichen. Das separate Cas-Modul unterstützt die vereinfachte Rekombinations-basierte Montage von Cas9-Helfern mithilfe des Assembly-Hosts EcoRed. Die gewonnenen Helfer sind in der Lage, das Hefegenom an jeder definierten Position zu schneiden und so eine markerfreie Integration zu ermöglichen.

Um die Funktionalität und Kompatibilität dieser Module zu überprüfen, haben wir ein erstes Beispiel-Toolkit für das Metabolic Engineering von Y. lipolytica zusammengestellt. Der Grundsatz umfasst 147 Plasmide, zwei E. coli- und drei Y. lipolytica-Stämme (Ergänzungstabellen 8 und 9), die über Addgene erhältlich sein werden.

Diese beiden Module sind der zentrale Teil des Toolkits und bestehen aus einem modifizierten dreistufigen System, das an das S. cerevisiae MoClo-Toolkit23 angelehnt ist. Um die Austauschbarkeit von Teilen zwischen Laboren zu ermöglichen, wurden Restriktionsstellen (Ergänzungstabelle 3) und Überhänge (Ergänzungstabelle 2) so konzipiert, dass sie mit früheren Y. lipolytica GG-Toolkits (Ergänzungsabbildungen 2–6) kompatibel sind 36, 37, 42. Der Grundsatz der Lvl0-Plasmide enthält 40 verschiedene Teile, darunter Promotoren, Gene, Terminatoren, selektierbare Marker, HAs sowie Vektorrückgrate mit E. coli-Fluoreszenzreportern.

Das Exp-Modul ist das einzige Modul, das mehrere Montageschritte umfassen kann (Ergänzende Abbildungen 8, 10–15). Abhängig von der verwendeten Strategie muss ein leerer Vektor mit dem bevorzugten Marker, Integrationsort (d. h. HAs), Ebene und Unterebene ausgewählt werden, wie unten erläutert. Jedes leere Lvl1 kann verwendet werden, um eine einzelne TU unter Verwendung von Lvl0-Plasmiden mit dem Promotor, Gen und Terminator von Interesse zusammenzustellen. Jede zusammengesetzte Lvl1-Kassette kann verwendet werden, um entweder ein einzelnes Gen zu überexprimieren oder ein Lvl2-Plasmid zusammenzustellen, das mehrere TUs enthält. Die Unterebene der Lvl1-Plasmide (1, 2 und 3) bestimmt die Position der TU in der nachfolgenden Lvl2-Anordnung. Die Unterebene des Lvl2-Plasmids (2 und 3) gibt die Anzahl der TUs an, die darauf zusammengesetzt werden können. Mit dem bereitgestellten Toolkit können bis zu drei TUs zusammengebaut werden, diese Zahl kann jedoch in Zukunft bei Bedarf noch weiter erhöht werden36.

Jedes Lvl1- oder Lvl2-Plasmid enthält spezifische 500-bp-HAs, die die Integration der Überexpressionskassetten in einen definierten Genomort ermöglichen. Zunächst wurden 16 intergene Regionen in Y. lipolytica W29 ausgewählt (Ergänzungstabelle 5), funktionell charakterisiert (Ergänzungsabbildung 27) und für die Zusammenstellung weiterer 80 leerer Lvl1- und Lvl2-Vektoren verschiedener Unterebenen verwendet. Die Loci auf jedem Chromosom wurden nummeriert und entsprechend als IntA1, IntA2 usw. bezeichnet. Ein zusätzlicher Satz von Vektoren wurde mit Zeta-Sequenzen geliefert, die für die Zufallsintegration verwendet werden können43. Um eine Standardnomenklatur beizubehalten, haben wir ein Benennungssystem entwickelt, das alle erforderlichen Informationen für jeden Vektor abkürzt (Ergänzende Abbildungen 7, 9). Beispielsweise ist pE8US1.1 ein leerer Lvl1.1-Vektor mit HAs für die Integration am Locus 8 auf dem Chromosom E, der einen URA3- und Spectinomycin-Resistenzmarker enthält.

Das Pro-Modul wird durch den einzigartigen leeren Vektor pProUA-mScarlet gebildet. Dieser Vektor enthält das hrGFP-Gen unter der Regulierung des inserierten Promotors (Ergänzende Abbildungen 24 und 25), was fluoreszenzbasierte Aktivitätstests ermöglicht. Folglich steht jeder auf diesem Vektor platzierte Promotor sofort sowohl für den Aufbau von TUs als auch für die Integration in Y. lipolytica zur funktionellen Charakterisierung zur Verfügung (Abb. 1). Am Beispiel des Promotors von ALK1 in Y. lipolytica betrug die beobachtete Assemblierungseffizienz des pProUA-ALK1-Plasmids 100 % (18/18) (ergänzende Abbildung 29 und ergänzende Tabelle 17).

Das Del-Modul basiert auf einem einzelnen Vektor, der für die Eintopfmontage von Plasmiden der pDel-Serie entwickelt wurde, die Genunterbrechungen ermöglichen. Der leere Vektor pDelUK-RG enthält die URA3-Kassette, flankiert von sowohl RFP- (mScarlet) als auch sfGFP-Genen, die für die bakterielle Expression entwickelt wurden. Während der GG-Assemblierung werden beide Reporter durch PCR-amplifizierte HAs ersetzt, die das zu entfernende Gen flankieren (Ergänzende Abbildungen 16 und 18). Die korrekten Klone können visuell durch das Fehlen beider Fluorophore überprüft werden (ergänzende Abbildung 17). Als Beispiel wurde der pDelUK-AAT1-Vektor für die Zerstörung des AAT1-Gens zusammengestellt. Von den GFP/RFP-negativen Kolonien zeigten 50 % (9/18) durch Restriktionsanalyse die korrekte Struktur (ergänzende Abbildung 30).

Das Toolkit wurde entwickelt, um den Wechsel zwischen verschiedenen HAs mit bereits zusammengestellten TUs zu ermöglichen. Dieses Merkmal wurde durch die Einführung von zwei AarI-Stellen vom Typ IIS erreicht, die das Vektorrückgrat mit HAs vom zentralen Abschnitt, der TUs beherbergt, trennen. Dies ermöglicht einen reversiblen GG-Teilaustausch zwischen leeren und zusammengesetzten Überexpressionsvektoren, der durch veränderte Antibiotikaresistenz und Ausfall von sfGFP selektiert werden kann (ergänzende Abbildung 19). Um die Effizienz des HA-Austauschs zu demonstrieren, haben wir drei TUs von pZUA2.3-HPD1-ARO4-ARO7 (mit Zeta-Integrationsflanken) zur Integration im IntE8-Locus auf den leeren Vektor pE8US1.1 übertragen. 100 % (8/8) der durch Spectinomycin-Resistenz und GFP-negativen Phänotyp ausgewählten Transformanten umfassten das Plasmid pE8US-HPD1-ARO4-ARO7 (ergänzende Abbildung 31).

Um die HAs aus dem Del-Modul für die Integration von Überexpressionskonstrukten verfügbar zu machen, wurde der URA3-Marker auf der pDel-Serie von zwei AarI-Stellen flankiert, die das Aussetzen dieses Markers ermöglichen. Die Durchführung einer GG-Reaktion ermöglicht die irreversible Übertragung von TUs von Lvl1- und Lvl2-Vektoren in zusammengesetzte pDel-Serien, die HAs eines Zielgens tragen (ergänzende Abbildung 20). Unter Verwendung der Konstruktionen pE8US-HPD1-ARO4-ARO7 und pDelUK-AAT1 haben wir das Plasmid pDelUK-AAT1::HPD1-ARO4-ARO7 mit einer Effizienz von 58, 3% (7/12) zusammengestellt (ergänzende Abbildung 32).

Das MEx-Modul ermöglicht einen schnellen Wechsel von der markerfreien zur markerbasierten Integration ohne zusätzliche GG-Schritte. Dies wird durch die Transformation einer beliebigen erforderlichen GG-Reaktionsmischung (z. B. aus Exp-, Del- oder Int-Modulen) in zwei verschiedene E. coli-Stämme erreicht. Einer dieser Stämme ist ein regulärer Transformationswirt (z. B. DH5alpha), während der andere der EcoCre-Stamm ist, der zur Überexpression von Cre-Rekombinase entwickelt wurde (Abschnitt 1.6 des Zusatzmaterials). Da die Markersequenz von Lox66- und Lox71-Stellen flankiert wird, wird dieser Teil in EcoCre-Zellen sofort eliminiert (ergänzende Abbildung 21). Durch die parallele Zusammenstellung beider Plasmidversionen können wir in Fällen, in denen die markerfreie Integration nicht effizient ist, sofort zu einem markerbasierten Ansatz zurückkehren. Die URA3-Exzision unter Verwendung des EcoCre-Stammes mit den Plasmiden pC2US1.1-hrGFP, pD12US1.1-hrGFP und pE8US1.1-hrGFP zeigte eine Effizienz von 100 % (24/24) (ergänzende Abbildung 33).

Der Cas9-Helfer ist ein episomaler Vektor, der für Nourseothricin (Nat)-Resistenz sorgt und sowohl Cas9 als auch den Guide (gRNA) exprimiert. Dieses Modul ermöglicht den Aufbau einer neuen gRNA unter Verwendung eines einzelnen 90-Basen-Oligonukleotids, das die 20 Basen kodiert, die für die Sequenzerkennung erforderlich sind (Ergänzende Abbildungen 22 und 23). Dieses Oligonukleotid wird mit dem leeren Helfer pCasNA-RK im rekombinierenden E. coli-Stamm EcoRed cotransformiert. Da pCasNA-RK eine gegenselektierbare Kassette (rpsL-kanR) enthält, können gewünschte Rekombinanten durch Streptomycinresistenz isoliert werden. Die Assemblierungseffizienz von Cas9-Helfern wurde unter Verwendung von drei zufällig generierten 20-Basen-Erkennungssequenzen getestet, was zu den Plasmiden pCasNA-Rdm1, pCasNA-Rdm2 und pCasNA-Rdm3 führte (Ergänzungstabelle 17). Der Prozentsatz korrekter Klone betrug 79,4 % (27/34) (ergänzende Abbildung 34). Das Toolkit enthält einen Satz vorgefertigter Cas9-Helfer für die markerfreie Integration in 16 Standard-Loci (Ergänzungstabelle 8).

Die Effizienz markerfreier Knockouts wurde mithilfe der ARO8- und ARO9-Gene bewertet. Ein Y. lipolytica-Ku70-Mutantenstamm wurde mit verschiedenen Kombinationen aus Cas9-Helfer und markerfreier Genunterbrechungskassette co-transformiert. Für jedes Gen wurden drei alternative gRNA-Sequenzen getestet. Die Störungseffizienzen in einzelnen Experimenten schwankten zwischen 50 % und 100 %, während der Durchschnitt der drei bei 77,8 % (28/36) lag (ergänzende Abbildung 35).

Um die Effizienz der markerfreien Integration von Überexpressionskonstrukten zu überprüfen, wurden die Loci IntC2, IntD12 und IntE8 ausgewählt. Dementsprechend wurden drei markerfreie Lvl1-Plasmide, die das hrGFP-Gen unter dem TEF1-Promotor enthielten, mit entsprechenden Cas9-Helfern im prototrophen Ku70-mutierten Y. lipolytica-Stamm co-transformiert. Mehrere durch Nat-Resistenz ausgewählte, schnell wachsende Kolonien aus jedem Transformationsexperiment wurden durch Kolonie-PCR verifiziert und auf grüne Fluoreszenz getestet. Die Effizienz der markerfreien Integration schwankte zwischen 44,4 % und 88,9 %, mit einem Durchschnitt von 64 % (32/50) (ergänzende Abbildung 36).

Um das Screening-System zu testen, wurden mehrere Promotorbibliotheken erstellt. Als Quelle für Promotoren wählten wir ribosomale Y. lipolytica-Gene, die für Proteine ​​großer (38 Gene) und kleiner (26 Gene) Untereinheiten kodieren, sowie 29 weitere Gene, von denen eine hohe Expression erwartet wird (Abschnitt 8.1 des Zusatzmaterials). Darüber hinaus wurde eine Bibliothek von 43 Hybridpromotoren entworfen, die die Upstream-Regionen von Genen verschiedener Hefearten kombinieren, darunter Candida hispaniensis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Komagataella phaffii, Ogataea polymorpha, S. cerevisiae und Y. lipolytica (Abschnitt 8.2 von Ergänzungsmaterial). Alle getesteten Promotoren wurden als Plasmide der pPro-Serie zusammengesetzt und mithilfe von Cas9-Helfer- und Nat-Selektion in den IntC2-Locus des Ura-Ku70-Mutantenstamms integriert. Transformanten wurden zunächst durch Uracil-Prototrophie verifiziert und dann durch PCR bestätigt. Starke Promotoren wurden visuell durch Biomassefluoreszenz überprüft (Abb. 2, ergänzende Abb. 28 und 43). Die relative Stärke jedes Promotors wurde entweder mit einem Plattenlesegerät oder mit Durchflusszytometrie während der exponentiellen Wachstumsphase in zwei verschiedenen Medien gemessen (Abb. 2, Ergänzungstabellen 12–15). Wir haben eine Vielzahl von Promotoren mit unterschiedlicher Stärke identifiziert, was die Anzahl der charakterisierten Promotoren für Y. lipolytica deutlich erhöht. Interessanterweise identifizierten wir 7 stärkere Promotoren als TEF1, 5 Hybrid- und 2 ribosomale Promotoren.

Im Pro-Modul kann ein verstärkter Promotor mithilfe der RFP-Dropout-Auswahl einfach in einem einzigen GG-Schritt zusammengestellt werden. Resultierende Plasmide der pPro-Serie können sowohl für die TU-Assemblierung im Exp-Modul als auch für den Promotor-Assay nach Integration in das Hefegenom verwendet werden. Die Einzelkopie-Integration in den Standard-Locus wird durch ein co-transformiertes Cas9-Helferplasmid erleichtert. Transformanten werden zunächst anhand der vom episomalen Helfer kodierten Nat-Resistenz selektiert, gefolgt von einer Überprüfung des Ura+-Phänotyps, die die Integration des Konstrukts bestätigt. Die abgebildete 96-Well-Platte zeigt die Fluoreszenz der Y. lipolytica-Transformantenbibliothek mit 93 nativen Promotoren, die in YPD-Medium gezüchtet wurden (Abschnitt 8.1 des Zusatzmaterials). Die beiden unteren Felder enthalten Balkendiagramme mit 93 nativen und 43 Hybridpromotoren, die jeweils mit einem Plattenlesegerät und einem Durchflusszytometer untersucht wurden. Die Daten wurden unter Verwendung des Elternstamms S234 (0 %) ausgeblendet und durch TEF1-Promotoraktivität (100 %) normalisiert. Für jeden Promotor wurde die GFP-Fluoreszenz in minimalen (blau) und reichen (roten) Medien mit entweder 2 % Glucose (YNBD, YPD) oder 2 % Glycerin (YNBG und YPG) als Kohlenstoffquelle untersucht. Es werden zwei biologische Replikate gezeigt, die unabhängige Transformanten mit demselben Konstrukt verwenden. Quelldaten werden als Zusatzdaten 1 bereitgestellt.

Um den Nutzen unserer verbesserten CRISPR/Cas9-Methodik zu beweisen, haben wir uns entschieden, durch rationales Engineering einen HGA-produzierenden Y. lipolytica zu entwickeln. Unter alkalischen Bedingungen wird HGA spontan oxidiert und polymerisiert unter Bildung von Pyomelanin, einem hervorragenden Bestandteil natürlicher Sonnenschutzmittel und Kosmetika45. Darüber hinaus ist HGA der biochemische Vorläufer zweier verschiedener Familien hochwertiger Moleküle, Plastoquinole und Tocopherole46. Trotz ihres hohen kommerziellen Potenzials basieren die verfügbaren Technologien zur Herstellung von HGA und Pyomelanin auf der Biotransformation teurer aromatischer Aminosäuren47. Aromaten werden über den Shikimat-Weg biosynthetisiert und gehen von zwei Zwischenprodukten des Zentralstoffwechsels aus, Phosphoenolpyruvat und Erythrose-4-phosphat. Tyrosin teilt mit HGA das gemeinsame Zwischenprodukt 4-Hydroxyphenylpyruvat, einen direkten Vorläufer für beide Moleküle (Abb. 3a).

a Schematische Darstellung des in Y. lipolytica entwickelten HGA-Produktionswegs. Grüne Pfeile, überexprimierte Schritte. Rote Pfeile, inaktivierte Reaktionen. Lila Pfeile, enzymatische Reaktionen, die vermutlich von zwei anderen ORFs im HGA-Abbaucluster von Y. lipolytica kodiert werden. Neben den Reaktionen werden Gene angezeigt, die entsprechende enzymatische Schritte kodieren. Metaboliten werden wie folgt gekürzt: PEP Phosphoenolpyruvat, E4P Erythrose-4-Phosphat, DAHP 3-Desoxy-D-Arabino-Heptulosonat 7-Phosphat, DHQ 3-Dehydroquinat, DHS 3-Dehydro-Shikimat, SHIK Shikimat, SHP Shikimat-3- Phosphat, EP3P 5-Enolpyruvyl-shikimat-3-phosphat, CHA-Chorismat, PPA-Prephenat, HPP para-Hydroxy-Phenylpyruvat, PPY-Phenylpyruvat, MAA 4-Maleylacetoacetat, FAA 4-Fumarylacetoacetat, FUM-Fumarat, AAС-Acetoacetat, Tyr L-Tyrosin, Phe L-Phenylalanin. b Zusammenfassung der in HGA-produzierenden Stämmen eingeführten Modifikationen. Die Symbole Delta und Aufwärtspfeil werden verwendet, um die Deletion bzw. Überexpression entsprechender Gene anzuzeigen. c Akkumulation von HGA durch gentechnisch veränderte Stämme nach 14-tägiger Kultivierung in YNB-Medium mit 9 % Glucose. Es werden zwei biologische Replikate gezeigt. Die Quelldaten werden als ergänzende Daten 1 bereitgestellt. d Sichtbare Anreicherung von Pyomelanin durch gentechnisch veränderte Stämme in der Kulturbrühe nach 7-tägiger Kultivierung im YNB-Medium mit 2 % Citrat.

Zunächst wählten wir mehrere Gene, die mutmaßliche aromatische Aminotransferasen kodieren, als Ziele für das Engineering aus. Diese Aktivität entzieht dem HGA den Kohlenstofffluss und führt zur Akkumulation von Tyrosin und Phenylalanin. Darüber hinaus sind diese beiden Aminosäuren an der Rückkopplungshemmung mehrerer Schritte des Shikimat-Wegs beteiligt48, 49. Die meisten Organismen besitzen zwei Arten aromatischer Aminotransferasen, die Ähnlichkeit entweder mit dem Aro8-Protein von S. cerevisiae oder TyrB von E. coli aufweisen ist eng mit Aat1 von Aspergillus sp50,51 verwandt. In Y. lipolytica beobachteten wir zwei Paraloge jedes Typs mit den Namen ARO8, ARO9 bzw. AAT1, AAT2. Unter Verwendung eines markerfreien Integrationsansatzes haben wir drei (ARO8, ARO9 und AAT2) von vier mutmaßlichen Aminotransferase-Genen in einer Ku70-Mutante und isolierten Stämmen mit allen möglichen Kombinationen dieser drei Deletionen zerstört (ergänzende Abbildung 37). Allerdings gelang die markerfreie Störung des vierten Aminotransferase-Gens (AAT1) in der Dreifachmutante trotz zahlreicher Versuche nicht. Bemerkenswert ist, dass die gleiche Deletion des AAT1-Gens bei einem Elternstamm gut funktionierte. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Inaktivierung des vierten Gens die Lebensfähigkeit von Y. lipolytica negativ beeinflusst. Um den Selektionsdruck zu erhöhen, wechselten wir zu einem markerbasierten Konstrukt, das das URA3-Gen enthält. Gemäß unseren Annahmen ermöglichte uns die Anwendung des auxotrophen Markers die Isolierung eines Stammes mit allen vier Genstörungen sowie anderer Stämme mit Kombinationen dieser vier Deletionen. Der Phänotyp des langsamen Wachstums wurde immer in Transformationsexperimenten beobachtet, bei denen Deletionen von AAT1- und AAT2-Genen kombiniert wurden (ergänzende Abbildungen 38 und 39). Daher deuten diese Ergebnisse auf eine epistatische Interaktion – auch bekannt als synthetisches Enhancement18 – zwischen diesen beiden Genen hin.

Als nächstes wählten wir drei Überexpressionsziele mit dem Potenzial, die De-novo-Synthese von HGA zu verbessern; ARO4, ARO7 und HPD1. Wir haben die mutierten S. cerevisiae-Gene ARO4K229L und ARO7G141S ausgewählt, die für rückkopplungsresistente Enzyme kodieren, von denen bekannt ist, dass sie die Stoffwechselflüsse über den Shikimat-Weg verstärken52,53. Das dritte Gen, HPD1, kodiert für eine 4-Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase von Y. lipolytica54. Alle drei Gene wurden mit dem starken TEF1-Promotor in den Lvl1-Vektoren zusammengesetzt und in einer Lvl2-Kassette kombiniert. Versuche, alle drei TUs mithilfe eines markerfreien Ansatzes miteinander zu integrieren, führten nicht zur Isolierung der gewünschten Transformanten, unabhängig vom verwendeten Empfängerstamm, z. B. mit oder ohne Deletionen des Aminotransferase-Gens. Durch die separate Transformation aller drei Gene unter Verwendung eines markerfreien Ansatzes konnten wir die Gene ARO7G141S und HPD1 überexprimieren, während mit ARO4K229L keine Kolonien isoliert wurden (Abschnitt 7.1 des Zusatzmaterials). Gleichzeitig ermöglichte ein Kontrollexperiment mit markerbasierter Konstruktion die Überexpression von ARO4K229L, korrekte Klone waren jedoch im Vergleich zu falschen Transformanten immer kleiner (ergänzende Abbildung 40). Aufgrund der Wachstumsdefekte sowohl der ARO4K229L-Überexpression als auch der ∆aat1∆aat2-Doppeldeletion haben wir beschlossen, diese beiden Modifikationen mithilfe von kombiniertem CRISPR/Cas9 und markerbasierter Selektion zusammenzusetzen. Sowohl dreifache (∆aro8∆aro9∆aat2) als auch vierfache (∆aro8∆aro9∆aat2∆aat1) Mutantenstämme wurden mit dem markerbasierten Konstrukt (pE8US-HPD1-ARO4-ARO7) und dem entsprechenden Cas9-Helfer ( pCasNA-IntE8). Wir selektierten zunächst das Helferplasmid im flüssigen Medium mit Nat und dann die integrative Konstruktion auf dem festen Medium ohne Uracil. Diese Methode ermöglichte die Isolierung von dreifachen und vierfachen Aminotransferase-Mutantenderivaten mit der Überexpression von drei erforderlichen Genen, die als S946 bzw. S948 bezeichnet werden.

Schließlich beschlossen wir, den Abbauweg von HGA zu untersuchen und zu inaktivieren. Allerdings war dieser Weg bei Y. lipolytica noch unbekannt. In den meisten Organismen, einschließlich Pilzen, beginnt der HGA-Abbauweg mit der Aktivität der Homogentisat-1,2-Dioxygenase55. Durch die detaillierte Analyse des Y. lipolytica W29-Genoms und die Neusequenzierung der ausgewählten Region konnten wir einen ORF identifizieren, der bei der vorherigen Analyse des gesamten Genoms übersehen wurde. Wir haben diesen ORF als HMG2 bezeichnet und er kodiert für ein Protein, das der Homogentisat-1,2-Dioxygenase anderer Spezies sehr ähnlich ist (GenBank-Zugangsnummer MZ387986). Dieses Gen ist die letzte einzigartige Sequenz auf Chromosom D, gefolgt von repetitiven Elementen. Interessanterweise haben wir neben diesem Gen auch zwei Gene identifiziert, die für mutmaßliche Fumarylacetoacetat-Hydrolase und Glutathion-S-Transferase kodieren, von denen angenommen wird, dass sie zusammen mit HMG2 am HGA-Abbau in anderen Pilzen beteiligt sind56. Darüber hinaus ist gut dokumentiert, dass Y. lipolytica häufig Mutanten produziert, die ein braunes Pigment absondern57,58, bei dem es sich um Pyomelanin handeln könnte, das aus Komponenten von Rich Media gebildet wird. Aufgrund der Position des HMG2-Gens gingen wir davon aus, dass solche Mutanten mit einer spontanen Verkürzung dieser Telomerregion verbunden sein könnten. Deshalb haben wir beschlossen, eine solche Verkürzung künstlich herbeizuführen, indem wir einen Cas9-Helfer verwenden, der in das HMG2-Gen schneidet. Tatsächlich induzierte die Transformation eines Stammes mit Wildtyp-Hintergrund eine intensive Bildung von braunem Pigment auf reichhaltigen Medien (ergänzende Abbildung 42). Anschließend induzierten wir ähnliche Verkürzungen in den Stämmen S946 und S948, was zur Entstehung von S997 bzw. S987 führte (Abb. 3b). Wir fanden heraus, dass beide Stämme in der Lage waren, HGA und Pyomelanin de novo auf Medien mit 9 % Glucose bzw. 2 % Citrat als einzelne Kohlenstoffquellen zu synthetisieren (Abb. 3c, d). Nach 14 Tagen Inkubation in Minimalmedium mit 9 % Glucose war der Stamm S997, ein Derivat der dreifachen Aminotransferase-Mutante, mit 373,8 mg/L HGA der beste Produzent, während S987 339,1 mg/L HGA produzierte (Ergänzungstabelle 11). ).

Zukünftige Fortschritte im Metabolic Engineering lebender Organismen werden in hohem Maße von der Verfügbarkeit schneller und effizienter DNA-Manipulationstechnologien abhängen. Dank hierarchischer und modularer GG-Systeme ist die schnelle Zusammenstellung mehrerer TUs kein wesentlicher limitierender Faktor mehr – aktuelle technische Toolkits zeigen jedoch noch Raum für Verbesserungen, um vielseitiger und verbreiteter zu werden, beispielsweise durch eine weitere Erleichterung der iterativen genomischen Integration der Überexpression und Löschkonstrukte.

Für Zwecke des Hefe-Metabolic-Engineerings erleichtert die Anwendung von CRISPR/Cas9 dank seiner markerfreien Fähigkeit die aufeinanderfolgende Integration von DNA. Im Vergleich zu einem System, das einen einzelnen integrativen Marker verwendet, beschleunigt diese Technologie den Dehnungsaufbau um mehr als das Zweifache (Abb. 4 und ergänzende Abb. 26). Die Konstruktion industriell relevanter Modifikationen erfordert jedoch in vielen Fällen immer noch die Robustheit markerbasierter Auswahl. Überraschenderweise stießen wir selbst in unserem demonstrativen Stoffwechsel-Engineering-Prozess auf toxische Auswirkungen sowohl der Überexpression (ARO4K229L) als auch der Genstörung (Kombination von ∆aat1 und ∆aat2), die wir nur mithilfe markerbasierter Konstrukte konstruieren konnten. Diese Fälle zeigen, dass die Möglichkeit, zu einem markerbasierten Ansatz zurückzukehren, für die schnelle Entwicklung komplexer Pfade von Vorteil ist. Hier bieten wir eine Lösung (MEx-Modul) an, die es ermöglicht, mit derselben DNA-Baugruppe sowohl markerfreie als auch markerbasierte Konstrukte herzustellen. Wenn daher eine Markierungsbasiskonstruktion erforderlich ist, kann dieses Modul mehrere Arbeitstage einsparen, da kein erneuter Zusammenbau erforderlich ist.

Das Toolkit ermöglicht den häufigen Wechsel zwischen markerbasierter und markerfreier Integration und kombiniert die Vorteile beider Technologien. Eine robustere markerbasierte Integration erfordert mindestens 11 Tage, da sie das Verfahren zur Markerwiederherstellung umfasst. Die Anwendung der markerfreien Integration mit CRISPR/Cas9 ermöglicht eine einzige Integrationsrunde in 5 Tagen (Bild oben). Jede einzelne GG-Assemblierungsreaktion könnte zur Produktion von Vektoren mit und ohne Marker verwendet werden. Gleichzeitig kann mithilfe des HA-Austauschsystems jede zusammengestellte Integrationskassette zur Überexpression, unabhängig von ihrer Komplexität, innerhalb von 2 Tagen an alternative Loci des Genoms umgeleitet werden. Darüber hinaus können sowohl gRNA als auch Spender innerhalb von nur zwei Tagen zu alternativen Loci umgeleitet werden (Bild unten links).

Darüber hinaus erfordert das Metabolic Engineering mit CRISPR/Cas9 eine häufige Umleitung der Spender-DNA und der gRNA-Konstrukte in Richtung alternativer Genomorte. Während dies mit Standardklonierungstechniken erreicht werden kann, die eine Amplifikation und/oder Gelreinigung von DNA-Fragmenten erfordern, konnten wir in der Literatur kein Beispiel finden, bei dem beide HAs in einem einzigen Montageschritt ersetzt werden können. Hier demonstrieren wir ein System des Eintopf-HA-Austauschs, das eine einzelne GG-Reaktion zwischen zwei unverdauten Plasmiden umfasst (Int-Modul). Dies ermöglicht die Umleitung komplexer Spender zu allen verfügbaren Integrationsorten, einschließlich Löschzielen, in nur zwei Tagen (Abschnitt 1.5 des Zusatzmaterials).

Obwohl inzwischen viele Techniken für die Neukodierung von gRNA auf Cas9-Helferplasmiden verfügbar sind, unterscheiden sie sich stark in der Anzahl und Komplexität der molekularen Manipulationen. Wir beschlossen, komplexe In-vitro-Schritte zu umgehen, indem wir die direkte Rekombination eines einzelnen Oligonukleotids auf dem leeren Helfer im manipulierten bakteriellen Assemblierungswirt (Cas-Modul) verwendeten. Dies verkürzt die für den Zusammenbau benötigte Zeit auf die Zeit, die für die bakterielle Transformation erforderlich ist, was schneller wäre als alle auf Klonen basierenden Techniken (Ergänzungstabelle 4).

Ein weiterer zentraler Bestandteil von Metabolic-Engineering-Projekten ist die strenge Kontrolle der Genexpression. Dies erfordert die Verfügbarkeit eines breiten Spektrums gut charakterisierter Promotoren für einzelne Wirtsorganismen. Unter Nutzung der einzigartigen Eigenschaften von CRISPR/Cas9 zur Gewährleistung der präzisen Integration einzelner Kopien haben wir ein effizientes Promotor-Screening-System (Pro-Modul) zusammengestellt. Ein einfacher Klonierungsschritt macht Promotoren sofort verfügbar, sowohl für den Aufbau von TUs als auch für In-vivo-Tests in Hefe.

In Kombination ermöglichen uns die oben beschriebenen Methoden, aktuelle CRISPR/Cas9-Technologien zu verbessern und ihr Potenzial für das Hefe-Metabol-Engineering zu steigern. Unter Verwendung des industriellen Arbeitstiers Y. lipolytica haben wir ein erstes Toolkit mit einer neuen und vielseitigen Architektur erstellt. Alle Verfahren wurden so konzipiert, dass sie die Geschwindigkeit maximieren und die Komplexität minimieren. Die Effizienz aller entworfenen Schritte wurde auf mindestens 50 % geschätzt, was das Toolkit effektiv macht.

Um die Effizienz unseres Promotor-Screening-Systems zu beurteilen, haben wir die Expression von 137 Promotoren während des Wachstums in zwei verschiedenen Medien vergleichend untersucht. Unter den 43 getesteten Hybridpromotoren beobachteten wir fünf, die eine höhere Fluoreszenz hervorriefen als der weit verbreitete TEF1-Promotor. Alle enthielten die proximale Region des TEF1p von Y. lipolytica und zeigten eine höhere Stärke als die nicht verkürzte Version. Dies könnte auf die Entfernung einer spezifischen Transkriptionsregulator-Bindungsstelle zurückzuführen sein, die die TEF1-Expression unterdrückt. Falls vorhanden, würde diese Stelle in der distalen Region liegen, die in diesen fünf starken Hybridpromotoren ersetzt wurde. Von den 94 getesteten natürlichen Promotoren zeigten zwei (RPL25 und TDH1) auch höhere Expressionsniveaus als der bisher bekannte stärkste Wildtyp-Promotor TEFin, eine Variation des TEF1-Promotors mit dem natürlichen Intron59. Diese neuen starken Promotoren werden für die Entwicklung von Y. lipolytica von großem Interesse sein. Der Rest der Bibliothek zeigte eine große Vielfalt an Expressionsniveaus (zwischen 0,1 % und 104 % von TEF1p), was für die Feinabstimmung der Stoffwechselwege hilfreich sein könnte. Dies ist die größte jemals in diesem Organismus getestete Bibliothek und erweitert die Gesamtzahl der in Y. lipolytica verfügbaren charakterisierten Promotoren erheblich60,61,62.

Als Proof of Concept für die Anwendung des Toolkits im Metabolic Engineering haben wir einen Y. lipolytica-Stamm konstruiert, der 373,8 mg/L HGA in Minimalmedien produziert. Zu diesem Zweck haben wir zuvor bekannte und mehrere neu charakterisierte Ziele für Überexpression und Deletion kombiniert. Interessanterweise haben wir einen „versteckten“ HGA-Abbauweg entdeckt, der in zwei der fünf sequenzierten Y. lipolytica-Stämme, WSH-Z06 und CLIB122, fehlt. Obwohl der kolineare Gencluster in evolutionär entfernten Myzelpilzen auftritt, können wir aufgrund der geringen Sequenzähnlichkeit nicht von einem horizontalen Gentransfer ausgehen (ergänzende Abbildung 41). Im Gegenteil, die Lage nahe dem Ende des Chromosoms deutete darauf hin, dass sein spontaner phylogenetischer Verlust das wahrscheinlichste Ereignis war. Durch die induzierte Verkürzung dieses Telomers konnten wir Pyomelanin-überakkumulierende Mutanten mit einem charakteristischen braunen Phänotyp erhalten. Spontanmutanten mit einem solchen Phänotyp kommen bei Y. lipolytica häufig vor und führen zu bekannten Problemen bei der Käseherstellung63. Die Entdeckung dieses Genclusters und seiner Lage gibt Aufschluss über den genetischen Hintergrund dieses Phänomens. Während dieses Manuskripts in Vorbereitung war, wurde eine Studie veröffentlicht, die die Überexpression von acht verschiedenen Genen in Y. lipolytica beschrieb, was zum ersten Beispiel einer HGA-Biosynthese de novo mit einem Endtiter von 650 mg/L54 führte. Allerdings wurde bei dieser Arbeit die größte Produktionssteigerung im letzten technischen Schritt durch die Isolierung eines einzigartigen Klons erreicht, der 15-mal mehr HGA produziert als andere Transformanten mit der gleichen Konstruktion. Dieser Klon wurde insbesondere aufgrund seiner intensiven braunen Pigmentierung ausgewählt, die unserer Hypothese nach auf eine ähnliche spontane Verkürzung der Telomere wie die hier beschriebene zurückzuführen sein könnte.

Zusammenfassend stellt unsere Arbeit ein Beispiel für ein verbessertes molekulares Toolkit dar, das auf das CRISPR/Cas9-basierte Metabolic Engineering zugeschnitten ist. Wir haben seinen Nutzen sowohl für die schnelle Stammkonstruktion als auch für die Charakterisierung einer großen Bibliothek von Promotoren bewiesen. Wir gehen davon aus, dass dieses Toolkit breitere Anwendungen dieser Spitzentechnologie in der Dehnungstechnik für industrielle Zwecke ermöglichen wird. Gleichzeitig ermöglicht die vielseitige Struktur des Toolkits eine Erweiterung seiner Fähigkeiten, beispielsweise um die Anzahl der Integrationsorte zu erhöhen, mehr TUs zusammenzustellen oder neue Module wie die für CRISPR/Cas9-Base-Editierung, CRISPR-Aktivierung oder CRISPR-Hemmung aufzunehmen oder CRISPR-Multiplexing. Darüber hinaus können die hier im Y. lipolytica-Modell nachgewiesenen methodischen Lösungen auf andere Organismen sowie auf andere Bereiche der Biotechnik angewendet werden.

Für die Kultivierung von Escherichia coli wurde Luria Bertani-Medium (VWR) verwendet. Das Hefe-Minimalwachstumsmedium war YNB (6,7 g/L Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren, Sigma-Aldrich), ergänzt mit Glucose (VWR, 101174Y) (YNBD), Glycerin (VWR, 24388.320) (YNBG) oder Natrium Citrat (VWR, 27833.237) in verschiedenen Konzentrationen, wie im Text angegeben. Bei Bedarf wurde YNB zusätzlich mit Casaminosäuren (Thermofisher, #223050), Uridin (Sigma-Aldrich, U3750), Aminosäuren [L-Leucin (Sigma-Aldrich, L8000), L-Histidin (Sigma-Aldrich, H8000)] ergänzt. L-Tyrosin (Sigma-Aldrich, T3754), L-Tryptophan (Sigma-Aldrich, T0254), L-Phenylalanin (Formedium, DOC0172), L-Aspartat (Sigma-Aldrich, 11195)] und Phosphatpuffer [Natriumhydrogenphosphat , Na2HPO4 (Alfa Aesar, 13437) und Natriumdihydrogenphosphat, NaH2PO4-2H2O(VWR, 28015.261)] wie angegeben. Das hefereiche Wachstumsmedium war YPD (10 g/L Hefeextrakt (Sigma-Aldrich, Y1625), 20 g/L Pepton (Merck, 1.11931) und 20 g/L Glucose) oder YPG (10 g/L Hefeextrakt, 20 g/L Pepton und 2 % Vol Glycerin). Die Rezepturen der Wachstumsmedien finden Sie auch in der Ergänzenden Anmerkung 4. Antibiotikakonzentrationen, einschließlich Ampicillin (Sigma-Aldrich, A8351), Kanamycin (Sigma-Aldrich, K1377), Chloramphenicol (Acros Organics, 22792026), Streptomycin (Sigma-Aldrich, S9137). ), Spectinomycin (Sigma-Aldrich, S4014), Nourseothricin (Fisher Scientific, AB-101-10ML) und Hygromycin (Life Technologies, 10687010) sind in der Ergänzungstabelle 7 zusammengefasst. Die Hygromycin-Auswahl wurde im Maker-Wiederherstellungsverfahren verwendet, wie in Abschnitt beschrieben 2.5 des Ergänzungsmaterials und der Ergänzungstabelle 6. Feste Medien wurden durch Zugabe von 20 g/L Agar (Merck, 05039-500 G) hergestellt. E. coli XL1-Blue (Stratagene) und Turbo (NEB) wurden für die Plasmidassemblierung und -vermehrung verwendet. Die in dieser Studie verwendeten Yarrowia lipolytica-Stämme stammen von Uracil-Auxotrophen (∆ura3) und Ku70-Mutanten (∆ura3∆ku70) ab, die aus W29 (MatA, Wildtyp; CLIB89) isoliert wurden, wie zuvor beschrieben64. Die Genotypen der Stämme, die Bestandteile des Toolkits sind, sind in der Ergänzungstabelle 9 zusammengefasst. Diese Stämme sind auf Anfrage bei der Russischen Staatlichen Sammlung industrieller Mikroorganismen, VKPM, erhältlich.

Alle beschriebenen Plasmide wurden mithilfe allgemeiner Klonierung65, Gibson-Assemblierung66, Golden-Gate-Assemblierung67 zusammengesetzt oder mithilfe kommerzieller Dienste (Twist Bioscience und Integrated DNA Technologies) synthetisiert. Die detaillierten Protokolle für den Zusammenbau von DNA-Konstrukten mit dem YaliCraft-Toolkit finden Sie in den Ergänzenden Anmerkungen 1 und 3. Die Sequenzen der in dieser Studie verwendeten Oligonukleotide sind in den Ergänzenden Tabellen 10 und 16 aufgeführt. Plasmidsequenzen werden im Genbank-Format (Supplementary data_set) bereitgestellt. 147 Plasmidkomponenten des Toolkits (Ergänzungstabelle 8) werden über das gemeinnützige Plasmid-Repository Addgene (##175597-175743) verfügbar sein.

Die E. coli-Stämme EcoRed und EcoCre waren Derivate des temperaturempfindlichen λcI857-Lysogens des Wildtyp-Stammes MG1655. Beide Stämme wurden mittels Rekombination68,69 konstruiert und enthielten den modifizierten λ-Prophagen für die temperaturinduzierbare Expression von λ-Red-Genen (gam, bet, exo) bzw. cre-Gen des Phagen P1. Der Stamm EcoRed enthielt eine deletierte cro-attR-Region der Prophagensequenz und enthielt die Mutation rpsL150 (Lys43Arg), um eine Gegenselektion mit dem Wildtyp-rpsL-Gen70 zu ermöglichen. Der Stamm EcoCre besaß außerdem eine N-attL-Deletion im Prophagen, wobei das cre-Gen unter der Kontrolle des PL-Promotors eingefügt wurde. Sequenzen der modifizierten λ-Prophagen, die beiden Stämmen entsprechen, werden als ergänzender Datensatz bereitgestellt.

Sowohl gRNA als auch Cas9 wurden vom episomalen Helferplasmid der pCasNA-Serie exprimiert, bei dem es sich um den modifizierten pCRISPRyl-Vektor3 handelte. Der neue Vektor enthält dieselbe autonome Replikationssequenz, dieselbe Cas9-Expressionskassette und regulatorische Elemente für die Expression von sgRNA71. Das Codon-optimierte Cas9-Gen aus Streptococcus pyogenes enthielt das C-terminale SV40-Kernlokalisierungssignal und wurde vom starken UAS1B8-TEF-Promotor (136 bp) exprimiert71. Die sgRNA-Expressionskassette besteht aus vier Elementen: Hybrid-RNA-Polymerase-III-Promotor SCR1'-tRNAGly, der crRNA-Sequenz (zielspezifisch 20 bp), gefolgt von der tracrRNA-Sequenz, fusioniert mit der Poly-T-Polymerase-III-Terminatorsequenz. Der LEU2 wurde durch einen selektierbaren Nourseothricin-Resistenzmarker ersetzt. Um die Erkennungseffizienz zu erhöhen, haben wir 9 Basen der Linkersequenz vom 5'-Ende von sgRNA72 entfernt. Der leere pCasNA-RK-Vektor enthält anstelle der zielspezifischen 20 bp die gegenselektierbare Kassette rpsL-kanR. Zur Integration des Überexpressions- oder Deletionskonstrukts wurde der entsprechende Spender mit dem Cas9-Helfer co-transformiert, der denselben Locus im Genom von Y. lipolytica erkannte (Ergänzende Anmerkung 2).

Die Aktivität der Promotoren in Y. lipolytica wurde anhand des Expressionskodon-optimierten Gens gemessen, das für das humanisierte grün fluoreszierende Renilla-Protein (hrGFP) kodiert73. Exponentiell wachsende Zellen wurden durch Durchflusszytometrie mit Attune NxT (Thermo Fisher Scientific) analysiert. Fluoreszenzdaten wurden von 10.000 Zellen gesammelt und mit der FlowJo-Software (Ashland, OR) analysiert. Alternativ wurde die Fluoreszenz mit einem CLARIOstar Plus Luminometer (BMG Labtech) gemessen. Aufgrund der Geräteverfügbarkeit in den verschiedenen Institutionen wurden zwei unterschiedliche Methoden verwendet. In ähnlicher Weise wurden je nach dem in jeder Sammlung verwendeten Kryoschutzmittel (Glycerin oder DMSO) zwei verschiedene Medien (Glycerin und Glucose) verwendet, um eine unerwünschte katabole Repression zu vermeiden. Weitere Charakterisierungsexperimente könnten alle Promotoren in den verschiedenen Medien und zu unterschiedlichen Zeitpunkten testen. Die Aktivität der Promotoren wurde mithilfe der Autofluoreszenz des Elternstamms ohne GFP ausgeblendet und auf die Aktivität des TEF1-Promotors normalisiert. Detaillierte Promotor-Assay-Verfahren mittels Durchflusszytometrie und Plattenlesegerät, beschrieben in den Abschnitten 2.6, 8.1 und 8.2 des Zusatzmaterials.

Die Gene, die für mutmaßliche aromatische Aminotransferasen kodieren, wurden durch Online-tBLASTn-Suche (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) identifiziert. Als Ergebnis wurden vier Gene zugeordnet, darunter ARO8 (YALI1_E24922g), ARO9 (YALI1_C06681g), AAT1 (YALI1_B03198g) und AAT2 (YALI1_F36966g). Der ORF, der HPD1 (YALI1_B28454g) entspricht, stimmte mit einer kürzlich veröffentlichten Sequenz54 überein. Aufgrund offensichtlicher Frameshift-Mutationen (CP017556.1 und CP028451.1) wurde dem HMG2-Gen während der Annotationen des Genoms kein Locus-Tag zugewiesen. Die überarbeitete Sequenz des HMG2-Gens von Y. lipolytica W29 ist bei GenBank unter der Zugangsnummer MZ387986 erhältlich.

Die Konzentration von Homogentisinsäure (HGA) wurde im Überstand nach der Biomassetrennung durch UPLC/MS mithilfe eines Agilent 1290 Affinitätschromatographen, verbunden mit einem Agilent 6550 Q-ToF-Massenspektrometer, geschätzt. Die Trennung wurde mit einer Agilent Zorbax Eclipse Plus C18-Säule (2,1 × 50 mm, 1,8 µm) und einem Acetonitrilgradienten von 0 % für 2 Minuten und anschließendem Anstieg auf 98 % über 0,5 Minuten bei einer Flussrate von 0,3 ml/min erreicht. Massenspektraldaten wurden im Negativionenmodus von m/z 90 bis 1000 mit einer Rate von 3 Spektren pro Sekunde während der gesamten Trennung erfasst. 0,2 µL wurden aus beiden Probenvertiefungen und aus im Handel erhältlichen HGA (H0751, Sigma-Aldrich) hergestellten Standardlösungen injiziert.

Die Experimente wurden in Duplikaten oder Wiederholungen durchgeführt, wie im jeweiligen Einzelfall erläutert. Der Durchschnitt wird im Balkendiagramm sowie in einzelnen Datenpunkten angezeigt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Quelldaten werden als Ergänzungsdaten 1 bereitgestellt. Plasmidsequenzen werden im Genbank-Format als Ergänzungsdatensatz bereitgestellt. Komponenten des Toolkits werden über das gemeinnützige Plasmid-Repository Addgene (##175597-175743) verfügbar sein. Weitere Informationen können auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor eingeholt werden.

Nielsen, J., Larsson, C., van Maris, A. & Pronk, J. Metabolic Engineering von Hefe zur Herstellung von Kraftstoffen und Chemikalien. Curr. Meinung. Biotechnologie. 24, 398–404 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

DiCarlo, JE et al. Genom-Engineering in Saccharomyces cerevisiae mit CRISPR-Cas-Systemen. Nukleinsäuren Res. 41, 4336–4343 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schwartz, CM, Hussain, MS, Blenner, M. & Wheeldon, I. Synthetische RNA-Polymerase-III-Promotoren erleichtern die hocheffiziente CRISPR-Cas9-vermittelte Genombearbeitung in Yarrowia lipolytica. ACS Synth. Biol. 5, 356–359 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Raschmanová, H., Weninger, A., Glieder, A., Kovar, K. & Vogl, T. Implementierung von CRISPR-Cas-Technologien in konventionellen und nichtkonventionellen Hefen: Aktueller Stand und Zukunftsaussichten. Biotechnologie. Adv. 36, 641–665 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

Tsai, CS et al. Schnelles und markerfreies Refactoring von Xylose-fermentierenden Hefestämmen mit Cas9/CRISPR. Biotechnologie. Bioeng. 112, 2406–2411 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jessop-Fabre, MM et al. EasyClone-MarkerFree: Ein Vektor-Toolkit zur markerlosen Integration von Genen in Saccharomyces cerevisiae über CRISPR-Cas9. Biotechnologie. J. 11, 1110–1117 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, L. et al. Effiziente CRISPR-Cas9-vermittelte Multiplex-Genombearbeitung in Hefen. Biotechnologie. Biokraftstoffe 11, 277 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, Q. et al. CRISPR-Cas9-vermittelte genomische Multiloci-Integration in Pichia pastoris. Mikro. Zellfakt. 18, 44 (2019).

Artikel Google Scholar

Holkenbrink, C. et al. EasyCloneYALI: CRISPR/Cas9-basierte synthetische Toolbox für die Entwicklung der Hefe Yarrowia lipolytica. Biotechnologie. J. 13, e1700543 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

Laughery, MF et al. Neue Vektoren für die einfache und optimierte CRISPR-Cas9-Genombearbeitung in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 32, 711–720 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cai, P., Gao, J. & Zhou, Y. CRISPR-vermittelte Genombearbeitung in nichtkonventionellen Hefen für biotechnologische Anwendungen. Mikro. Zellfakt. 18, 63 (2019).

Artikel Google Scholar

Kretzschmar, A. et al. Erhöhte Häufigkeit homologer Integration bei Yarrowia lipolytica-Stämmen, denen die nicht homologe Endverbindung fehlt. Curr. Genet 59, 63–72 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Babaei, M. et al. Entwicklung von ölhaltiger Hefe als Wirt für die fermentative Bernsteinsäureproduktion aus Glucose. Front Bioeng. Biotechnologie. 27, 361 (2019).

Artikel Google Scholar

Gao, C. et al. Robuste Bernsteinsäureproduktion aus Rohglycerin unter Verwendung von technisch hergestellter Yarrowia lipolytica. Biotechnologie. Biokraftstoffe 9, 179 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Milne, N. et al. Stoffwechsel-Engineering von Saccharomyces cerevisiae zur De-novo-Produktion von Psilocybin und verwandten Tryptamin-Derivaten. Metab. Ing. 60, 25–36 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Makanae, K., Kintaka, R., Makino, T., Kitano, H. & Moriya, H. Identifizierung dosisempfindlicher Gene in Saccharomyces cerevisiae mithilfe der genetischen Tauziehen-Methode. Genome Res 23, 300–311 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Giaever, G. et al. Funktionelle Profilierung des Saccharomyces cerevisiae-Genoms. Natur 418, 387–391 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Adames, NR, Gallegos, JE & Peccoud, J. Hefe-Geninteraktionsscreenings im Zeitalter von CRISPR/Cas. Curr. Genet 65, 307–327 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Babaei, M. et al. Erweiterung des EasyClone-MarkerFree-Toolkits für das Saccharomyces cerevisiae-Genom um neue Integrationsstellen. FEMS Heferes. 21, foab027 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu, W., Gao, J., Zhai, X. & Zhou, YJ Screening neutraler Stellen für Metabolic Engineering der methylotrophen Hefe Ogataea polymorpha. Synth. Syst. Biotechnologie. 6, 63–68 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, M. et al. Die CRISPR-vermittelte Multigen-Integration ermöglicht die Umgestaltung des Shikimat-Signalwegs für eine verbesserte 2-Phenylethanol-Biosynthese in Kluyveromyces marxianus. Biotechnologie. Biokraftstoffe 14, 3 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brady, JR et al. Identifizierung verbesserter Stellen für die heterologe Genintegration mithilfe von ATAC-seq. ACS Synth. Biol. 9, 2515–2524 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, ME, DeLoache, WC, Cervantes, B. & Dueber, JE Ein hochcharakterisierter Hefe-Toolkit für den modularen, mehrteiligen Aufbau. ACS Synth. Biol. 4, 975–986 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nguyen, N., Quail, MMF & Hernday, AD Ein effizientes, schnelles und recycelbares System für die Crisp-vermittelte Genombearbeitung bei Candida albicans. mSphere 2, e00149–17 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gowers, G.-OF et al. Verbesserte Betulinsäure-Biosynthese durch synthetische Hefe-Chromosomen-Rekombination und halbautomatisches schnelles LC-MS-Screening. Nat. Komm. 11, 868 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Y. et al. Ein gRNA-tRNA-Array für CRISPR-Cas9-basiertes schnelles Multiplex-Genom-Editing in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Komm. 10, 1053 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, XT et al. tCRISPRi: einstellbare und reversible, einstufige Kontrolle der Genexpression. Wissenschaft. Rep. 6, 39076 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McCleary, WR Anwendung von Promotor-Swapping-Techniken zur Kontrolle der Expression chromosomaler Gene. Appl Microbiol Biotechnol. 84, 641–648 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rajkumar, AS, Varela, JA, Juergens, H., Daran, J.-MG & Morrissey, JP Biologische Teile für die synthetische Biologie von Kluyveromyces marxianus. Front Bioeng. Biotechnologie. 7, 97 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Weninger, A. et al. Erweiterung des CRISPR/Cas9-Toolkits für Pichia pastoris um effiziente Spenderintegration und alternative Resistenzmarker. J. Cell Biochem 119, 3183–3198 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Storici, F., Durham, CL, Gordenin, DA & Resnick, MA Chromosome ortsspezifische Doppelstrangbrüche werden durch Oligonukleotide in Hefe effizient für die Reparatur gezielt. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 100, 14994–14999 (2003).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Park, YK & Ledesma-Amaro, R. Warum ist Yarrowia lipolytica gut für die Industrie geeignet? Trends Biotechnologie. 41, 242–254 (2023).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Larroude, M., Trabelsi, H., Nicaud, J.-M. & Rossignol, T. Eine Reihe von Yarrowia lipolytica CRISPR/Cas9-Vektoren zur Nutzung der Wildtyp-Stammvielfalt. Biotechnologie. Lette. 42, 773–785 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Baisya, D., Ramesh, A., Schwartz, C., Lonardi, S. & Wheeldon, I. Genomweite Funktionsscreenings ermöglichen die Vorhersage hochaktiver CRISPR-Cas9- und -Cas12a-Leitfäden in Yarrowia lipolytica. Nat. Komm. 13, 922 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schwartz, C. & Wheeldon, I. CRISPR-Cas9-vermittelte Genombearbeitung und Transkriptionskontrolle in Yarrowia lipolytica. Methoden Mol. Biol. 1772, 327–345 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Celińska, E. et al. Golden Gate Assembly-System zur Manipulation komplexer Signalwege in Yarrowia lipolytica. Mikro. Biotechnologie. 10, 450–455 (2017).

Artikel Google Scholar

Larroude, M. et al. Ein modulares Golden Gate-Toolkit für die synthetische Biologie von Yarrowia lipolytica. Mikro. Biotechnologie. 12, 1249–1259 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Li, YW et al. YALIcloneNHEJ: Ein effizientes modulares Klonierungs-Toolkit für die NHEJ-Integration des Multigen-Signalwegs und der Terpenoidproduktion in Yarrowia lipolytica. Front Bioeng. Biotechnologie. 9, 816980 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Egermeier, M., Sauer, M. & Marx, H. Golden Gate-basierte Metabolic Engineering-Strategie für Wildtyp-Stämme von Yarrowia lipolytica. FEMS Microbiol Lett. 366, fnz022 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bredeweg, EL et al. Eine molekulargenetische Toolbox für Yarrowia lipolytica. Biotechnologie. Biokraftstoffe 10, 2 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Wong, L., Engel, J., Jin, E., Holdridge, B. & Xu, P. YaliBricks, ein vielseitiges genetisches Toolkit für ein optimiertes und schnelles Pathway-Engineering in Yarrowia lipolytica. Metab. Ing. Komm. 5, 68–77 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

He, Q., Szczepańska, P., Yuzbashev, TV, Lazar, Z. & Ledesma-Amaro, R. De-novo-Produktion von Resveratrol aus Glycerin durch Manipulation verschiedener Stoffwechselwege in Yarrowia lipolytica. Metab. Ing. Komm. 11, e00146 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Juretzek, T. et al. Vektoren für die Genexpression und Amplifikation in der Hefe Yarrowia lipolytica. Yeast 18, 97–113 (2001).

3.0.CO;2-U" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F1097-0061%2820010130%2918%3A2%3C97%3A%3AAID-YEA652%3E3.0.CO%3B2-U" aria-label="Article reference 43" data-doi="10.1002/1097-0061(20010130)18:23.0.CO;2-U">Artikel CAS PubMed Google Scholar

Albert, H., Dale, EC, Lee, E. & Ow, DW Ortsspezifische Integration von DNA in Wildtyp- und mutierte Lachsstellen im Pflanzengenom. Plant J. 7, 649–659 (1995).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Martínez, LM, Martinez, A. & Gosset, G. Produktion von Melaninen mit rekombinanten Mikroorganismen. Front Bioeng. Biotechnologie. 7, 285 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Shen, B. et al. Fermentative Produktion von Vitamin-E-Tocotrienolen in Saccharomyces cerevisiae unter kälteschockbedingter Temperaturkontrolle. Nat. Komm. 11, 5155 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ben Tahar, I., Kus-Liśkiewicz, M., Lara, Y., Javaux, E. & Fickers, P. Charakterisierung eines ungiftigen Pyomelaninpigments, das von der Hefe Yarrowia lipolytica produziert wird. Biotechnologie. Prog. 36, e2912 (2020).

PubMed Google Scholar

Luttik, MAH et al. Linderung der Rückkopplungshemmung bei der Biosynthese aromatischer Aminosäuren von Saccharomyces cerevisiae: Quantifizierung der metabolischen Wirkung. Metab. Ing. 10, 141–153 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lütke-Eversloh, T. & Stephanopoulos, G. L-Tyrosin-Produktion durch deregulierte Escherichia coli-Stämme. Appl. Mikrobiol. Biotechnologie. 75, 103–110 (2007).

Artikel PubMed Google Scholar

Chao, YP, Lai, ZJ, Chen, P. & Chern, JT Erhöhte Umwandlungsrate von L-Phenylalanin durch Kopplungsreaktionen von Aminotransferasen und Phosphoenolpyruvatcarboxykinase in Escherichia coli K-12. Biotechnologie. Prog. 15, 453–458 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Romagnoli, G. et al. Die Löschung des ARO8-Gens von Saccharomyces cerevisiae, das eine aromatische Aminosäuretransaminase kodiert, steigert die Phenylethanolproduktion aus Glucose. Hefe 32, 29–45 (2015).

CAS PubMed Google Scholar

Liu, Q. et al. Neuverkabelung des Kohlenstoffstoffwechsels in Hefe für die Produktion aromatischer Chemikalien auf hohem Niveau. Nat. Komm. 10, 4976 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gu, Y., Ma, J., Zhu, Y., Ding, X. & Xu, P. Engineering Yarrowia lipolytica als Chassis für die De-novo-Synthese von fünf aromatischen Naturprodukten und Chemikalien. ACS Synth. Biol. 9, 2096–2106 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Larroude, M., Onésime, D., Rué, O., Nicaud, JM & Rossignol, T. Ein Yarrowia lipolytica-Stamm, der für die Pyomelanin-Produktion entwickelt wurde. Mikroorganismen 9, 838 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schmaler-Ripcke, J. et al. Produktion von Pyomelanin, einer zweiten Art von Melanin, über den Tyrosin-Abbauweg in Aspergillus fumigatus. Anwendungsumgebung. Microbiol 75, 493–503 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Fernández-Cañón, JM & Peñalva, MA Charakterisierung eines Pilz-Maleylacetoacetat-Isomerase-Gens und Identifizierung seines menschlichen Homologen. J. Biol. Chem. Rev. 273, 329–337 (1998).

Artikel PubMed Google Scholar

Bassel, J., Hambright, P., Mortimer, R. & Bearden, AJ Mutante der Hefe Saccharomycopsis lipolytica, die Protorphyrin IX ansammelt und ausscheidet. J. Bakteriol. 123, 118–122 (1975).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barth, G. & Weber, H. Genetische Studien an der Hefe Saccharomycopsis lipolytica. Inaktivierung und Mutagenese. Z. Allg. Mikrobiol. 23, 147–157 (1983).

CAS PubMed Google Scholar

Tai, M. & Stephanopoulos, G. Entwicklung des Push-and-Pull-Verfahrens der Lipidbiosynthese in der Ölhefe Yarrowia lipolytica für die Biokraftstoffproduktion. Metab. Ing. 15, 1–9 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Larroude, M., Rossignol, T., Nicaud, JM & Ledesma-Amaro, R. Werkzeuge der synthetischen Biologie für die Entwicklung von Yarrowia lipolytica. Biotechnologie. Adv. 36, 2150–2164 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xiong, X. & Chen, S. Erweiterung der Toolbox für die Genexpression von Yarrowia lipolytica um neuartige induzierbare, reprimierbare und hybride Promotoren. ACS Synth. Biol. 9, 2208–2213 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhao, Y. et al. Hybrid-Promotor-Engineering-Strategien in Yarrowia lipolytica: Isoamylalkoholproduktion als Teststudie. Biotechnologie. Biokraftstoffe 14, 149 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fernandez-Cannon, JM et al. Mäuse mit Maleylacetoacetat-Isomerase (MAAI/GSTZ)-Mangel zeigen einen Glutathion-abhängigen nichtenzymatischen Bypass im Tyrosinkatabolismus. Mol. Zellbiol. Rev. 22, 4943–4951 (2002).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Yuzbasheva, EY et al. Der mitochondriale Citratträger in Yarrowia lipolytica: Seine Identifizierung, Charakterisierung und funktionelle Bedeutung für die Produktion von Zitronensäure. Metab. Ing. 54, 264–274 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sambrook, J., Fritsch, EF & Maniatis, T. Molekulares Klonen: Ein Laborhandbuch. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). https://books.google.co.uk/books/about/Molecular_Cloning.html?id=8WViPwAACAAJ&redir_esc=y. Zugriff am 23. März 2023.

Gibson, DG et al. Enzymatischer Aufbau von DNA-Molekülen mit bis zu mehreren hundert Kilobasen. Nat. Methoden 6, 343–345 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S. & Marillonnet, S. Ein modulares Klonsystem für den standardisierten Zusammenbau von Multigenkonstrukten. PLoS One 6, e16765 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu, D. et al. Ein effizientes Rekombinationssystem für das Chromosomen-Engineering in Escherichia coli. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 97, 5978–5983 (2000).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Datsenko, KA & Wanner, BL Einstufige Inaktivierung chromosomaler Gene in Escherichia coli K-12 mithilfe von PCR-Produkten. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 97, 6640–6645 (2000).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Russell, CB & Dahlquist, FW Austausch von chromosomalen und Plasmid-Allelen in Escherichia coli durch Selektion auf Verlust eines dominanten Antibiotika-Empfindlichkeitsmarkers. J. Bakteriol. 171, 2614–2618 (1989).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shabbir Hussain, M., Gambill, L., Smith, S. & Blenner, MA Technische Promotorarchitektur in der Ölhefe Yarrowia lipolytica. ACS Synth. Biol. 5, 213–223 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Borsenberger, V. et al. Mehrere Parameter steuern die Effizienz von CRISPR/Cas9-induzierten Genveränderungen in Yarrowia lipolytica. J. Mol. Biol. 430, 4293–4306 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Blazeck, J., Liu, L., Redden, H. & Alper, H. Optimierung der Genexpression in Yarrowia lipolytica durch einen Hybrid-Promotor-Ansatz. Appl. Umgebung. Microbiol 77, 7905–7914 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Tigran V. Yuzbashev

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Tigran V. Yuzbashev, Davina Patel und Rodrigo Ledesma-Amaro

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NRC „Kurchatov Institute“ – GosNIIgenetika, Kurchatov Genomic Centre, 1-st Dorozhny Pr., 1, Moskau, 117545, Russland

Olga E. Melkina und Dmitrii Bubnov

Kaesler Forschungsinstitut, Kaesler Nutrition GmbH, Fischkai 1, 27572, Bremerhaven, Deutschland

Heiko Dietz

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TVY und RL-A. konzipierte das Exp-Modul. TVY und EYY haben die Module Pro, Del, Cas, Int und MEx konzipiert. TVY und EYY haben eine neue Methodik entwickelt. RL-A überwachte die Arbeiten. TVY und OEM haben die meisten Plasmidteile und nativen Promotoren entworfen und zusammengestellt. HD hat die Hybrid-Promoter entwickelt. TVY und DP führten die Durchflusszytometrie durch und verfassten das Handbuch. TVY und DMB entwickelten In-vivo-Rekombinationstechniken. TVY hat die erste Version des Manuskripts geschrieben. Nachfolgende Versionen wurden von RL-A und HDHD und RL-A überarbeitet. konzipierte das Projekt zur Unterstützung der Forschung.

Korrespondenz mit Tigran V. Yuzbashev oder Rodrigo Ledesma-Amaro.

Die Kaesler Nutrition GmbH erklärt, dass sie konkurrierende Interessen an hybriden Promotorsequenzen hat. Alle anderen Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Communications Biology dankt Oliver Konzock und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: [Tobias Goris und Anam Akhtar]. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Yuzbashev, TV, Yuzbasheva, EY, Melkina, OE et al. Ein DNA-Assemblierungs-Toolkit zur Erschließung des CRISPR/Cas9-Potenzials für das Metabolic Engineering. Commun Biol 6, 858 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05202-5

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Eingegangen: 26. März 2023

Angenommen: 01. August 2023

Veröffentlicht: 18. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05202-5

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